Физические основы биосенсорики


                       СЕВАСТОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ


Г.П. ГОРБЕНКО
В.М. ТРУСОВА
М.П. ЕВСТИГНЕЕВ




                ФИЗИЧЕСКИЕ
                ОСНОВЫ БИОСЕНСОРИКИ




УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ





znanium.com

Москва ВУЗОВСКИЙ УЧЕБНИК ИНФРА-М
2021

УДК 577(075.8)
ББК 28.07я73

     Г67











      Горбенко Г.П.
Г67 Физические основы биосенсорики : учебное пособие / Г.П. Горбен-

       ко, В.М. Трусова, М.П. Евстигнеев. — Москва : Вузовский учебник : ИНФРА-М, 2021. — 140 с.
         ISBN 978-5-9558-0415-6 (Вузовский учебник)
         ISBN 978-5-16-010613-7 (ИНФРА-М, print)
         ISBN 978-5-16-102429-4 (ИНФРА-М, online)

         В учебном пособии описаны физико-химические основы функционирования биосенсоров, различные конфигурации биосенсорных анализаторов, принципы их действия и современные тенденции развития биосенсорики.
         Значительное внимание уделено молекулярному узнаванию и системам усиления сигнала на молекулярном уровне. Подробно рассмотрены методы иммобилизации биологических компонентов биосенсоров. Отдельные разделы посвящены детальному описанию процессов, лежащих в основе формирования аналитического сигнала в электрохимических и оптических биосенсорах. Приведены примеры применения биосенсоров в различных областях жизнедеятельности.
         Предназначено для студентов и аспирантов физических и биологических специальностей.

УДК 577(075.8)
ББК 28.07я73











© Горбенко Г.П., Трусова В.М., Евстигнеев М.П., 2015

ISBN 978-5-9558-0415-6 (Вузовский учебник)      Евстигнеев М.П., ²⁰
ISBN 978-5-16-010613-7 (ИНФРА-М, print) © Вузовский учебник, ISBN 978-5-16-102429-4 (ИНФРА-М, online) 2015

СОДЕРЖАНИЕ


ВВЕДЕНИЕ.......................................6
РАЗДЕЛ 1. БИОСЕНСОРЫ КАК НОВЫЙ КЛАСС АНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ........................8
1.1. Предмет и задачи сенсорики................8
1.1.1. Основные понятия сенсорики..............8
1.1.2. Предмет и задачи сенсорики.............11
1.2. Классификация биосенсоров................11
1.3. История создания биосенсоров.............14
1.4. Вопросы для самоконтроля.................17
РАЗДЕЛ 2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯБИОСЕНСОРОВ...................18
2.1. Молекулярное узнавание...................18
2.2. Комплекс фермент-субстрат................23
2.2.1. Гидролазы..............................25
2.2.2. Оксидазы (Н₂О₂-генерирующие ферменты)..26
2.2.3. Дегидрогеназы..........................27
2.3. Комплекс антиген-антитело................28
2.4. Комплекс гормон-рецептор.................29
2.5. Молекулярные системы усиления............31
2.5.1. Ферментативноеусиление.................32
2.5.2. Модуляция неспецифическойреакции.......33
2.5.3. Смещениеравновесия.....................35
2.5.4. Каскадноеусиление......................36
2.6. Вопросы для самоконтроля.................37
РАЗДЕЛ 3. МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ
БИОЛОГИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ СЕНСОРОВ..............39
3.1. Адсорбция на носителях...................40
3.2. Ковалентное присоединение к носителям....41
3.2.1. Металлохелатный метод..................44
3.3. Сшивание с бифункциональными реагентами..47
3.4. Включение в пространственную сетку гелей.48
3.5. Микрокапсулирование......................51

3

3.6. Сравнительная характеристика методов иммобилизации белков..........................................55
3.7. Методы иммобилизации липидов...............57
3.7.1. Химическая модификация поверхности подложки... 58
3.7.2. Формирование липидных мембран на твердой подложке........................................59
3.8. Вопросы для самоконтроля...................64
РАЗДЕЛ 4. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ.............65
4.1. Физико-химические основы функционирования электрохимических сенсоров. Электрохимическая цепь.... 65
4.2. Основные характеристики электрохимических процессов.......................................69
4.3. Классификация электродов...................73
4.4. Ионселективные электроды...................75
4.5. Стеклянный электрод........................78
4.6. Другие типы ионселективных электродов......83
4.7. Ферментные электроды.......................84
4.8. Современные тенденции развития электрохимических биосенсоров.....................................87
4.9. Вопросы для самоконтроля...................88
РАЗДЕЛ 5. ОПТИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ.................90
5.1. Распространение света в оптическом волокне.90
5.1.1. Полное внутреннее отражение..............90
5.1.2. Затухающее поле..........................94
5.1.3. Поверхностный плазмонныйрезонанс.........96
5.2. Классификация оптических датчиков..........98
5.3. Датчикисмодулируемойамплитудой...........100
5.3.1. Прямые внешние сенсоры..................101
5.3.2. Прямые внутренние сенсоры...............102
5.3.3. Непрямые внешние сенсоры................103
5.3.4. Непрямые внутренние сенсоры.............105
5.4. Датчики с модулируемой длиной волны......107
5.4.1. Прямые внешние флуоресцентные сенсоры....108
5.4.2. Прямые внутренние флуоресцентные сенсоры.108

4

5.4.3. Непрямые внешние флуоресцентные сенсоры.109
5.4.4. Непрямые внутренние флуоресцентные сенсоры... 113
5.5. Сенсоры, основанные на комбинационном рассеянии (КР-сенсоры).................................114
5.6. Датчики с фазовой модуляцией............117
5.7. Датчики с поляризационной модуляцией......122
5.8. Датчики с временной модуляцией..........123
5.9. Вопросы для самоконтроля................124
РАЗДЕЛ 6. ДРУГИЕ ТИПЫ БИОСЕНСОРОВ............127
6.1. Биосенсоры на объемных пьезоэлектрических резонаторах..................................127
6.2. Биосенсоры на поверхностных акустических волнах (ПАВ;........................................129
6.3. Калориметрические биосенсоры............130
6.4. Вопросы для самоконтроля................130
РАЗДЕЛ7. ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСЕНСОРОВ..................................132
7.1. Применение биосенсоров в медицине.......132
7.2. Применение биосенсоров для анализа объектов окружающей среды.............................135
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.....................137

5

ВВЕДЕНИЕ


      Одной из важнейших черт современной науки является формирование контактов между различными отраслями знаний, взаимопроникновение и взаимообогащение этих отраслей, возникновение на этой основе новых научных направлений. Среди таких направлений в последние десятилетия особенно интенсивно развивается биосенсорика, наука о новом классе датчиков -биосенсорах.
      Биосенсор - это аналитический прибор, в котором высокоспецифичные реакции между чувствительным биологическим элементом и веществом, уровень которого необходимо определить (аналитом), приводят к генерации сигнала, зависящего от концентрации аналита. Конструктивно биосенсор состоит из биоселективной мембраны или биоматрицы и физического элемента, который превращает биохимический сигнал в электронный. Возникновение биосенсорики является результатом интеграции многих отраслей науки и технологии -аналитической химии, электрохимии, физики твердого тела, биохимии,         биофизики,        микроэлектроники,
материаловедения. Важность биосенсорных анализаторов трудно переоценить. Биосенсоры находят все более широкое применение в различных сферах жизнедеятельности - медицине, сельском хозяйстве, охране окружающей среды, пищевом, фармацевтическом,

6

химическом производствах и т.д. Наиболее важными преимуществами биосенсоров являются высокая чувствительность и селективность, безреагентность и скорость анализа, широкий диапазон анализируемых веществ. Несмотря на бурное развитие биосенсорной концепции, и сегодня существует немало проблем, связанных, в частности, с необходимостью создания безопасных для организма датчиков, способных к продолжительному эффективному функционированию in vivo,   обеспечения возможности многоразового
использования биосенсоров, избежания нежелательного влияния интерферирующих веществ и т.д. Преодоление этих и множества других нерешенных проблем невозможно без глубокого понимания процессов, которые протекают в биосенсорах, а также без знания свойств биологических и физических элементов датчиков.
      Цель данного пособия - ознакомить читателя с физико-химическими основами функционирования биосенсоров, принципами их действия и основными конфигурациями. Наряду с     детальным рассмотрением
фундаментальных концепций     работы   биосенсоров и
современных тенденций        развития   биосенсорных
анализаторов, достаточно     внимания    уделяется и
прикладным аспектам проблемы.

7

РАЗДЕЛ 1.
БИОСЕНСОРЫ КАК НОВЫЙ КЛАСС АНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ

      1.1. Предмет и задачи сенсорики
      1.1.1. Основныепонятия сенсорики

      Сенсор - аналитическое устройство, в котором высокоспецифичные химические реакции между чувствительным химическим элементом и определяемым веществом (аналитом) формируют сигнал, зависящий от концентрации аналита.
      Биосенсор - аналитический прибор, содержащий биологический чувствительный элемент (ферменты, рецепторы, гормоны, антитела, нуклеиновые кислоты, надмолекулярные комплексы, внутриклеточные органеллы, клетки, микроорганизмы и т.д.). В биосенсоре аналитический сигнал формируется за счет биохимических процессов.
      Первичный отклик - изменение определенных характеристик химического или биологического чувствительного элемента сенсора в результате его взаимодействия с аналитом.
      Преобразователь (трансдуктор) - элемент сенсора, с помощью которого первичный отклик системы преобразуется в электрический, оптический, механический, термический или частотный аналитический сигнал. В качестве трансдуктора могут использоваться термисторы,


8

оптические волокна, электроды, пьезоэлектрические кристаллы и т.д.

полевые транзисторы,

      Головной каскад - система первичной обработки и усиления измеряемого сигнала.
      Селективность - способность сенсора к ответу только на узко специфический химический сигнал и относительная нечувствительность к неспецифическим воздействиям. Высокая селективность является одним из основных преимуществ биосенсоров по сравнению с другими видами датчиков.
      Быстродействие (время ответа) - время, необходимое для достижения стационарного состояния сенсора (постоянного сигнала) при изменении концентрации аналита. При больших временах ответа возможно проведение анализа в кинетическом режиме, т. е. без достижения стационарного состояния.
      Динамический диапазон (пределы измерения) сенсора - область значений анализируемого параметра, в которой детектируемый сигнал с высокой воспроизводимостью коррелирует со специфическим первичным откликом.
      Калибровочная кривая - зависимость аналитического сигнала (X) от концентрации аналита (С).
      Предел детектирования - самая низкая концентрация аналита (CLOD), которая приводит к генерации сигнала (XLOD), статистически отличимого от фонового сигнала.

9

       Чувствительность - соотношение детектируемого сигнала и концентрации аналита. Эта величина равна наклону калибровочной кривой S = dX I dC = ДХIДС. Чем выше чувствительность, тем ниже предел детектирования. Взаимосвязь между этими параметрами определяется соотношением CLOD = 3SBIS, где SB - стандартное отклонение фонового сигнала, измеряемого в отсутствие аналита. В таблице 1.1 приведена шкала концентраций аналита, измеряемых с помощью биосенсоров.
Таблица 1.1

Шкала концентраций аналита, используемых в биосенсорах.

Обозначение    Концентрация, Число молекул в
                  моль/л           1ц1      
Моль (М)             1           ~6х1017    
Миллимоль (тМ)     10'3          ~6х1014    
Микромоль (цМ)     10'6          -6Х1011    
Наномоль (пМ)      10'у          -6x10*     
Пикомоль (рМ)      10'12         ~6х105     
Фемтомоль (fM)     10'15         ~6х102     
Аттомоль (аМ)      10'18           0,6      
Зептомоль (гМ)     10'21         0,0006     

10

      1.1.2. Предмет и задачи сенсорики


      Предмет сенсорики - физико-химические основы функционирования сенсоров, принципы их действия, основные конфигурации сенсоров.
      Основная задача сенсорики - разработка и создание аналитических устройств, отвечающих требованиям высокой чувствительности, селективности, стабильности, воспроизводимости результатов измерения.

      1.2. Классификация биосенсоров

      Принципиальная схема биосенсора может быть представлена следующим образом (рис. 1.1):



Рисунок 1.1 - Принципиальная схема биосенсора

11

      Биосенсоры могут быть классифицированы по нескольким критериям (рис. 1.2).


Рисунок 1.2 - Классификация биосенсоров

      1.       По химической природе определяемого вещества (или по специфичности). Биосенсоры используются для измерения количества или активности широкого диапазона веществ - от простейших молекул, таких как газы (O₂, SO₂, H₂S, NO₂), ионы тяжелых металлов (Hg, Tl, Pb, Cd), до органических молекул (глюкоза, фенол и его производные, пестициды и т.д.), макромолекул и даже микроорганизмов. Таким образом, существуют отдельные группы биосенсоров на кислород, перекись водорода, глюкозу и т.д.


12

      2.        По типу биологического чувствительного элемента. В качестве биологического элемента могут использоваться:
   а)     ферменты (например, глюкозооксидаза, супероксиддисмутаза);
   б)     антитела (например, иммуноглобулин IgG);
   в)     другие функциональные белки (в частности, бактериородопсин);
   г)     ДНК, РНК;
   д)     надмолекулярные комплексы (например, фотосистема II);
   е)     клеточные органеллы (например, хлоропласты);
   ж)     клетки;
   з)     микроорганизмы (чаще всего бактерии);
   и)     срезы тканей растений и животных.
      3.        По принципу действия. По принципу действия, т.е. в зависимости от механизма чувствительности, биодатчики можно условно разделить на каталитические, аффинные, основанные на ингибировании и др. В каталитических датчиках биологически активными элементами являются ферменты, катализирующие определенную биохимическую реакцию (цепочку реакций) превращения субстрата, продукт которой может быть проанализирован трансдуктором. В аффинных сенсорах чувствительными элементами чаще всего являются антитела, специфически связывающие анализируемые молекулы. Биосенсоры, основанные на ингибировании определенных процессов, содержат ферменты, снижение активности которых коррелирует с концентрацией ингибирующего аналита.

13